بررسی برخی از خواص فیزیکوشیمیایی کربوکسی پپتیداز b استخراج شده از سلولها ی کشت داده شده روده میانی کنه ماده بالغ هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم

کنه ها از جمله انگلهای خارجی اغلب حیوانات می باشند، که علاوه بر اینکه مستقیما منجر به بیماری و آسیب در دام ها می گردند، خود به عنوان مهمترین ناقل برخی از پاتوژن ها، میکروب ها و ویروس ها از حیوانی به حیوان دیگر عمل می کنند. کنترل کنه ها و ایمن کردن دام ها علیه کنه ها امری مهم و ضروری است. یکی از روش های جدید کنترل کنه ها استفاده از نوعی واکسن نوترکیب است که با استفاده از آنتی ژن خاصی که در غشاء پایه سلولهای روده میانی کنه ها وجود دارد، طراحی و ساخته شده است. این واکسن ها به طور صددرصد بر روی گونه های کنه موجود در ایران (هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم ) موثر نمی باشند. بعد از خونخواری، کنه نیاز به جذب و هضم خون دارد، خون از طریق اندوسیتوز وارد سلولهای روده میانی شده و درون لیزوزوم ها و با کمک آنزیم های گوارشی هضم می شود. از طریق بلوکه کردن یکی از آنزیم های گوارشی می توان این پروسه را مختل کرد و به این طریق به کنه آسیب رسانده و آن را از دام جدا کرد. یکی از آنزیم های پروتئولیتیکی مهمی که در سیستم جذب و هضم خون اکثر حیوانات نقش دارد، کربوکسی پپتیداز b است، که با توجه به اثبات حضور آن در دستگاه گوارش کنه، می توان از آن به عنوان یک گزینه برای تهیه واکسن استفاده کرد. ما بعد از استخراج روده میانی کنه هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم، آنرا به بافر هنکس انتقال داده سپس به مدت 90 ثانیه با کلروهگزیدین 2/0 درصد شستشو دادیم. سپس به ترتیب با بافر هنکس، الکل 70 درصد و در نهایت روده ها مجددا در بافر هنکس چندین بار شستشو داده شدند. برای جداسازی بافتها و سلولها از یکدیگر از آنزیم کلاژنازmg/ml 2/0 استفاده کردیم، بعد از شستشو با بافر هنکس و fbs 15% سلولها را تحت شرایط rpm2400 و دمای 28 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ کردیم، با کمک محیط کشت مخصوص حشرات (t c-100) سلولها را کشت داده و بعد از 48 ساعت سلولهای رشد کرده و چسبیده شده به ته چاهکهای ول را جدا کرده ، محتویات سیتوپلاسمی را از غشاء سلولی بوسیله سانتریفوژ جدا کردیم. با کمک تریتون x-100 (2 درصد) پروتئین های غشاء سلولی را آزاد کردیم و با کمک استن، پروتئین های غشایی را رسوب دادیم. محلول رویی که حاوی پروتئین های سیتوپلاسمی است و محلول حاوی پروتئین های غشایی را به روش ژل فیلتراسیون کروماتوگرافی کردیم. فراکشن حاوی کربوکسی پپتیداز b را الکتروفورز کردیم و در نهایت فعالیت ویژه آنزیم 3/143 و وزن مولکولی آنرا 39810 بدست آوردیم. همچنین با توجه به بررسی های انجام شده جایگاه کربوکسی پپتیداز b را مانند دیگر موجودات در غشاء سیتوپلاسمی احتمال دادیم.